GlnR和Fnr介導(dǎo)植物乳桿菌WU14的Nir表達(dá)調(diào)控機(jī)制

本書為作者團(tuán)隊(duì)多年從事乳酸菌分子生物學(xué)和基因調(diào)控研究系列成果的總結(jié)。以植物乳桿菌WU14為研究對(duì)象，以乳酸菌亞硝酸鹽還原酶系統(tǒng)的調(diào)控為突破口，主要探討了乳酸菌氮代謝全局性調(diào)控蛋白GlnR和Fnr對(duì)亞硝酸還原酶Nir的調(diào)控機(jī)制，從轉(zhuǎn)錄水平和基因表達(dá)上著手分析亞硝酸鹽脅迫下植物乳桿菌WU14全局性轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白GlnR和Fnr及Nir對(duì)氧感應(yīng)機(jī)制，驗(yàn)證了Fnr與Nir和nir啟動(dòng)子以及Fnr與GlnR的相互作用，闡明了GlnR和Fnr對(duì)nir操縱子的多層次表達(dá)調(diào)控機(jī)理，以期為構(gòu)建乳酸菌氮代謝的基因轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)、明確基因轉(zhuǎn)錄的相互調(diào)控關(guān)系和關(guān)鍵調(diào)控基因提供理論和技術(shù)支持。
本書主要面向食品微生物發(fā)酵和應(yīng)用研究的科研工作者，特別適用于乳酸菌功能基因挖掘和基因調(diào)控研究領(lǐng)域的科研工作者，期望能夠?qū)κ称肺⑸锖鸵嫔肿由飳W(xué)等科研工作者的研究提供幫助。

徐波，1970年生，廣東石油化工學(xué)院教授，工學(xué)博士，一直致力于乳酸菌功能基因挖掘、乳酸菌基因工程和乳酸菌氮代謝基因調(diào)控等方面的研究工作。先后主持完成包括3項(xiàng)國(guó)家自然基金在內(nèi)的多項(xiàng)研究課題，主持完成6項(xiàng)本科生、研究生教改項(xiàng)目，發(fā)表學(xué)術(shù)論文46篇，其中SCI論文12篇，獲教學(xué)成果二等獎(jiǎng)1項(xiàng)，出版中文教材2部，申請(qǐng)發(fā)明專利3項(xiàng)。

1.原創(chuàng)性和系統(tǒng)性強(qiáng) 本書是對(duì)植物乳桿菌WU14全局性調(diào)控蛋白GlnR和Fnr對(duì)Nir表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究的系列成果的總結(jié)； 2.適用性廣 本書屬于生物科學(xué)與食品科學(xué)交叉學(xué)科，內(nèi)容先進(jìn)，讀者對(duì)象廣泛。

亞硝酸鹽是一種潛在的致癌物，隨著人們食品安全意識(shí)的提高，腌制食品中亞硝酸鹽污染的安全問題日益受到關(guān)注，這也是腌制食品生產(chǎn)中普遍面臨的問題。因此，如何降解亞硝酸鹽是腌制食品生產(chǎn)中亟待解決的關(guān)鍵問題，也是食品安全領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
作者及其團(tuán)隊(duì)成員在國(guó)家自然科學(xué)基金、江西省自然科學(xué)基金、江西省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目、廣東省自然科學(xué)基金、廣東省普通高校重點(diǎn)領(lǐng)域?qū)ｍ?xiàng)等項(xiàng)目的資助下，長(zhǎng)期開展乳酸菌來源的食品級(jí)亞硝酸鹽還原酶動(dòng)態(tài)降解食品腌制過程中所產(chǎn)生的亞硝酸鹽的理論和技術(shù)研究，在乳酸菌功能基因挖掘和基因調(diào)控、氮代謝和稀有糖生物轉(zhuǎn)化等領(lǐng)域取得了一系列的成績(jī)，在乳酸菌GlnR調(diào)控GAD機(jī)制、GlnR與Nir相互作用及表達(dá)調(diào)控機(jī)制、Fnr和Fur參與植物乳桿菌WU14亞硝酸鹽降解的調(diào)控機(jī)制和高產(chǎn)D-塔格糖工程菌株構(gòu)建與生物轉(zhuǎn)化、耐熱性和N-糖基化分子改良提高植物乳桿菌WU14 L-阿拉伯糖異構(gòu)酶催化效率等方面取得了積極成果，在國(guó)內(nèi)外高水平期刊上發(fā)表了數(shù)十篇學(xué)術(shù)論文，授權(quán)了多項(xiàng)國(guó)家發(fā)明專利，研究成果為乳酸菌氮代謝調(diào)控研究和亞硝酸鹽生物降解的發(fā)展提供了理論指導(dǎo)和技術(shù)支撐。
本書是對(duì)植物乳桿菌WU14全局性調(diào)控蛋白GlnR和Fnr對(duì)Nir表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究的系列成果的總結(jié)。全書分為7章，比較系統(tǒng)地從理論和技術(shù)等方面介紹了植物乳桿菌WU14利用亞硝酸鹽還原酶生物動(dòng)態(tài)降解亞硝酸鹽的基因調(diào)控機(jī)制，具體是在系統(tǒng)介紹腌制食品中亞硝酸鹽對(duì)人體的危害、亞硝酸鹽還原酶的分類和功能以及植物乳桿菌的氮代謝調(diào)控因子GlnR和Fnr研究現(xiàn)狀的基礎(chǔ)上，詳細(xì)介紹了植物乳桿菌WU14的Nir基因的食品級(jí)細(xì)胞內(nèi)高效誘導(dǎo)表達(dá)、Fnr和GlnR的重組表達(dá)和純化、Fnr和GlnR與Nir啟動(dòng)子的相互作用以及Fnr和GlnR與Nir的相互作用與表達(dá)調(diào)控機(jī)制。
本書由廣東石油化工學(xué)院徐波教授撰寫。本書撰寫過程中，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院姚斌院士、石鵬君研究員、伍寧豐研究員、張偉研究員等給予了大力支持，應(yīng)碧、昌曉宇、羅艷、孫志軍、曾浩、繆婷婷、邱胡林和沈風(fēng)飛等研究生也為本書的完成付出了辛勤的勞動(dòng)，在此表示衷心感謝！
本書是作者研究團(tuán)隊(duì)對(duì)乳酸菌亞硝酸鹽還原酶動(dòng)態(tài)降解亞硝酸鹽的基因和表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制研究的成果總結(jié)，期望能為食品微生物和益生菌研究領(lǐng)域的學(xué)者和學(xué)生提供一點(diǎn)理論和技術(shù)上的幫助。
限于作者水平，書中難免存在疏漏之處，敬請(qǐng)讀者批評(píng)指正。

徐波
2023年8月

第1章緒論001
1.1亞硝酸鹽與食品001
1.1.1亞硝酸鹽在食品行業(yè)的應(yīng)用001
1.1.2亞硝酸鹽對(duì)人體的危害001
1.1.3醬腌菜和泡菜中亞硝酸鹽的產(chǎn)生與控制002
1.2亞硝酸鹽還原酶002
1.2.1亞硝酸鹽還原酶降解亞硝酸鹽途徑002
1.2.2亞硝酸鹽還原酶的分類003
1.2.3亞硝酸鹽還原酶的功能003
1.3植物乳桿菌003
1.3.1植物乳桿菌的功能004
1.3.2植物乳桿菌的脫氮能力004
1.3.3植物乳桿菌在醬腌菜和泡菜中的應(yīng)用004
1.3.4植物乳桿菌WU14005
1.4細(xì)菌氮代謝研究005
1.4.1調(diào)控因子與啟動(dòng)子的相互作用005
1.4.2GlnR調(diào)控因子006
1.4.3Fnr調(diào)控因子010
1.4.4Fnr調(diào)控因子對(duì)細(xì)菌氮代謝的調(diào)控010
1.4.5luxS和HK等全局性調(diào)控因子對(duì)亞硝酸鹽代謝的調(diào)控010
1.5植物乳桿菌遺傳轉(zhuǎn)化體系011
1.5.1國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展011
1.5.2工業(yè)應(yīng)用011
參考文獻(xiàn)012

第2章亞硝酸鹽脅迫下植物乳桿菌WU14的Nir食品級(jí)高效誘導(dǎo)表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)研究020
2.1亞硝酸鹽脅迫下植物乳桿菌WU14對(duì)亞硝酸鹽降解能力分析021
2.2Nir基因克隆和生物信息學(xué)分析022
2.3重組質(zhì)粒pRNA48-Nir的構(gòu)建及Nir誘導(dǎo)表達(dá)026
2.4植物乳桿菌WU14的基因組測(cè)序和分析029
2.5結(jié)論030
參考文獻(xiàn)030


第3章亞硝酸鹽脅迫下植物乳桿菌WU14中GlnR與Nir相互作用研究032
3.1Trans 1/pET-30a/Nir表達(dá)載體的構(gòu)建與檢測(cè)034
3.1.1亞硝酸鹽還原酶保守片段Nir的獲取034
3.1.2Nir誘導(dǎo)表達(dá)載體的構(gòu)建034
3.1.3Nir蛋白誘導(dǎo)與SDS-PAGE分析034
3.2植物乳桿菌GlnR基因克隆和表達(dá)載體的構(gòu)建與檢測(cè)036
3.2.1T3-glnR構(gòu)建036
3.2.2pET-30a-glnR的表達(dá)載體構(gòu)建036
3.3GlnR與Nir啟動(dòng)子體外相互作用研究037
3.3.1pNir啟動(dòng)子基因擴(kuò)增及Trans1/T3/pNir菌落PCR驗(yàn)證037
3.3.2GlnR基因片段的重新獲得037
3.3.3誘餌載體與表達(dá)載體的構(gòu)建038
3.3.4細(xì)菌單雜交實(shí)驗(yàn)誘餌載體與表達(dá)載體酶切驗(yàn)證039
3.4結(jié)論043
參考文獻(xiàn)044

第4章亞硝酸鹽脅迫下植物乳桿菌WU14中GlnR與Nir表達(dá)調(diào)控機(jī)制研究046
4.1利用酵母雙雜交研究GlnR與Nir的互作與表達(dá)調(diào)控046
4.1.1亞硝酸鹽還原酶（Nir）基因和GlnR基因的克隆046
4.1.2GlnR-pGBKT7誘餌載體和報(bào)告載體Nir-pGADT7的構(gòu)建046
4.1.3菌落PCR檢測(cè)重組載體pAD-Nir和pBD-GlnR047
4.1.4融合載體的自激活和毒性檢測(cè)047
4.1.5亞硝酸鹽還原酶（Nir）和調(diào)控蛋白GlnR相互作用分析048
4.1.6植物乳桿菌WU14 RNA的提取048
4.2凝膠阻滯驗(yàn)證GlnR蛋白與Nir互作和表達(dá)調(diào)控049
4.2.1PCR擴(kuò)增GlnR基因050
4.2.2pPIC9-GlnR表達(dá)載體的構(gòu)建051
4.2.3SDS-PAGE分析重組載體pPIC9-GlnR的表達(dá)產(chǎn)物051
4.2.4pE-T30a-GlnR表達(dá)載體的構(gòu)建051
4.2.5GlnR蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)與純化052
4.2.6GlnR蛋白與亞硝酸鹽還原酶（Nir）的相互作用053
4.3qRT-PCR實(shí)驗(yàn)分析亞硝酸鹽脅迫GlnR對(duì)Nir的表達(dá)調(diào)控作用053
4.3.1WU14生長(zhǎng)曲線測(cè)定054
4.3.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）054
4.4結(jié)論057
參考文獻(xiàn)059

第5章Fnr參與植物乳桿菌WU14亞硝酸鹽降解的調(diào)控機(jī)制061
5.1Fnr和GlnR的重組表達(dá)和純化061
5.1.1fnr和glnR基因擴(kuò)增及序列分析061
5.1.2Fnr和GlnR克隆載體的構(gòu)建062
5.1.3Fnr和GlnR重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建063
5.1.4Fnr和GlnR重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化和檢測(cè)064
5.2凝膠阻滯（EMSA）驗(yàn)證Fnr和GlnR與nir啟動(dòng)子的相互作用067
5.2.1PglnR和Pnir啟動(dòng)子序列的擴(kuò)增生物素標(biāo)記067
5.2.2EMSA驗(yàn)證Fnr與Pnir啟動(dòng)子的互作068
5.2.3EMSA驗(yàn)證GlnR和Pnir啟動(dòng)子的互作069
5.2.4EMSA驗(yàn)證Fnr和PglnR啟動(dòng)子的互作069
5.3qRT-PCR驗(yàn)證fnr和nir的相對(duì)表達(dá)量070
5.3.1不同培養(yǎng)條件下植物乳桿菌WU14的生長(zhǎng)曲線070
5.3.2植物乳桿菌WU14降解NaNO2能力測(cè)試072
5.3.3植物乳桿菌WU14的RNA提取073
5.3.4RNA反轉(zhuǎn)錄074
5.3.5fnr和nir相對(duì)表達(dá)量驗(yàn)證074
5.4結(jié)論076
參考文獻(xiàn)078

第6章植物乳桿菌WU14 L-阿拉伯糖異構(gòu)酶分子生物學(xué)、發(fā)酵工藝優(yōu)化及熱穩(wěn)定性分子改良079
6.1高產(chǎn)D-塔格糖植物乳桿菌WU14的L-AI基因的分析、食品級(jí)誘導(dǎo)表達(dá)及其酶學(xué)性質(zhì)的研究080
6.1.1植物乳桿菌WU14生物轉(zhuǎn)化D-塔格糖分析081
6.1.2L-AI基因的擴(kuò)增與TA克隆081
6.1.3高產(chǎn)D-塔格糖乳酸菌L-AI基因的核苷酸序列分析082
6.1.4高產(chǎn)D-塔格糖乳酸菌L-AI蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析083
6.1.5高產(chǎn)D-塔格糖乳酸菌L-AI蛋白跨膜螺旋分析和信號(hào)肽分析084
6.1.6高產(chǎn)D-塔格糖乳酸菌L-AI蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析084
6.1.7高產(chǎn)D-塔格糖植物乳桿菌WU14的L-AI酶學(xué)性質(zhì)研究085
6.1.8重組PCR技術(shù)去除植物乳桿菌WU14 L-AI基因中的NcoⅠ酶切位點(diǎn)088
6.1.9重組質(zhì)粒pRNA48-L-AI的構(gòu)建及驗(yàn)證090
6.1.10SDS-PAGE篩選nisin誘導(dǎo)L-AI基因表達(dá)的最佳誘導(dǎo)劑量及誘導(dǎo)時(shí)間092
6.1.11L.lactis NZ9000/pRNA48-L-AI重組菌的遺傳穩(wěn)定性分析094
6.1.12L.lactis NZ9000/pRNA48-L-AI重組菌的L-AI酶學(xué)性質(zhì)研究095
6.2植物乳桿菌WU14高產(chǎn)D-塔格糖的發(fā)酵工藝優(yōu)化和分離提純研究098
6.2.1L-AI發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型研究098
6.2.2D-塔格糖分離純化的研究102
6.2.3硼酸鹽催化L-AI產(chǎn)D-塔格糖的研究106
6.3植物乳桿菌WU14的L-AI耐熱性分子改良108
6.3.1L-AI同源建模110
6.3.2突變位點(diǎn)的預(yù)測(cè)111
6.3.3突變體的表達(dá)112
6.3.4野生型及突變型L-AI最適溫度及熱穩(wěn)定性的測(cè)定112
6.3.5野生型及突變型L-AI最適pH及pH穩(wěn)定性的測(cè)定114
6.4結(jié)論114
參考文獻(xiàn)118

第7章植物乳桿菌WU14 6-磷酸-β-葡萄糖苷酶的基因克隆、蛋白質(zhì)表達(dá)以及生物信息學(xué)分析122
7.1植物乳桿菌WU14的8個(gè)β-葡萄糖苷酶編碼基因的克隆123
7.2SDS-PAGE分析重組蛋白123
7.3目的基因BglAW14、BglBW14、BglCW14、BglDW14、BglEW14、BglFW14、BglGW14和BglHW14的生物信息學(xué)分析125
7.3.1氨基酸序列分析、跨膜結(jié)構(gòu)和信號(hào)肽預(yù)測(cè)125
7.3.2氨基酸序列比對(duì)分析及系統(tǒng)發(fā)育樹分析126
7.3.3蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)128
7.3.4亞細(xì)胞定位128
7.4結(jié)論129
參考文獻(xiàn)129