殼聚糖衍生物納米疫苗技術與應用

本書分別以N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖納米粒、N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/N,O-羧甲基殼聚糖納米粒以及N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖-鋁納米粒作為疫苗佐劑和遞送載體，以豬流行性腹瀉滅活病毒為模型抗原，研制新型豬流行性腹瀉納米滅活疫苗，并系統(tǒng)地研究了該疫苗的相關性能和免疫效力。本書是一本系統(tǒng)論述殼聚糖衍生物作為疫苗佐劑和遞送系統(tǒng)的學術專著，可為疫苗佐劑的研制以及進口替代和原始創(chuàng)新提供技術理論支撐并奠定應用基礎。
本書適宜于從事疫苗佐劑、動物疫苗、殼聚糖衍生物開發(fā)及在納米生物材料等領域從事科研、教學、規(guī)劃、設計、生產(chǎn)、管理等工作的人員閱讀使用，尤其對從事疫苗佐劑研發(fā)和聚合物遞送載體材料研究的相關科研工作者和專業(yè)學生具有重要的參考價值。

趙凱，教授，博導，享受省政府特殊津貼，國家“萬人計劃”科技創(chuàng)新領軍人才和科技部“創(chuàng)新人才推進計劃”中青年科技創(chuàng)新領軍人才入選者，教育部新世紀優(yōu)秀人才支持計劃。擔任中國畜牧獸醫(yī)學會畜牧獸醫(yī)生物技術學分會常務理事、黑龍江省畜牧獸醫(yī)學會常務理事、黑龍江省畜牧獸醫(yī)學會動物傳染病分會副理事長、黑龍江省微生物學會常務理事、黑龍江省蛋白質組學學會常務理事、黑龍江省發(fā)酵工程學會常務理事、黑龍江省免疫學會理事、黑龍江省生物工程學會理事。 主要從事動物疫苗佐劑及遞送系統(tǒng)、納米檢測試劑和生物制藥方面的科學研究工作。近年主持國家自然科學基金面上5項、國家重點研發(fā)計劃2項、科技部國際合作專項、教育部重點、黑龍江省杰出青年科學基金、黑龍江省自然科學基金重點項目、黑龍江省科技攻關項目、哈爾濱市科技攻關項目等科研課題32項。

本書是一部利用納米聚合物制備技術，以可生物降解材料殼聚糖的衍生物作為載體，以豬流行性腹瀉滅活疫苗為模型藥物，應用納米技術對它們進行劑型改換，制備新型緩釋豬流行性腹瀉滅活病毒疫苗，并通過動物免疫實驗評價該疫苗的綜合免疫效果的學術專著，作者結合多年的多項重大科研成果，并參閱了大量的國內外文獻撰寫而成。全書共分十章。在內容安排上注重了科學性、先進性、系統(tǒng)性和條理性，圖文并茂，體例規(guī)范，語言通順流暢，涉及內容豐富而廣泛。該研究內容屬于國家重點研發(fā)項目內容。

豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒引起的一種急性、接觸性強的腸道傳染疾病，感染仔豬死亡率高，致使養(yǎng)豬業(yè)遭受巨大經(jīng)濟損失。疫苗免疫是預防豬流行性腹瀉等傳染病最有效的方法之一。滅活疫苗具有高水平免疫、高穩(wěn)定性、高保護率等優(yōu)點，但豬流行性腹瀉病毒滅活疫苗存在抗原呈遞及加工的有效性差、生物利用度低等缺點。免疫佐劑是指提前或與抗原一起注射到機體內能提高免疫效果及改變免疫應答類型的一種非特異性免疫增強劑。安全有效的疫苗佐劑的研制及開發(fā)對豬流行性腹瀉病毒滅活疫苗免疫效果的提高至關重要。
黏膜疫苗可在黏膜部位有效誘導對病原體的保護性免疫反應，也可在全身誘導抗原特異性的體液免疫和細胞介導的免疫反應。黏膜接種還能有效誘導持久性B淋巴細胞和T淋巴細胞的記憶。此外，黏膜途徑接種疫苗與全身途徑接種疫苗相比具有生產(chǎn)成本低、無注射損傷風險、消除疼痛和恐懼等優(yōu)勢。
提高疫苗黏膜免疫效力的關鍵是用優(yōu)良的黏膜免疫佐劑，合適的黏膜佐劑能夠誘導機體分泌大量的免疫球蛋白A（IgA)，并通過激活B細胞和樹突狀細胞（DC細胞）誘導全身免疫。疫苗佐劑通常是免疫刺激分子，如細胞因子、Toll樣受體或其他病原體等，而基于病原體類的疫苗佐劑容易引起機體非必要的免疫反應，甚至造成細胞毒性反應。殼聚糖等非病毒生物材料作為疫苗佐劑，能誘導機體產(chǎn)生強烈的體液、細胞和局部黏膜免疫應答反應，同時具有良好的生物安全性。研究表明，殼聚糖衍生物納米顆粒是最有前途的疫苗佐劑和遞送載體之一。殼聚糖可以通過多種方式進行改性，以提高黏膜給藥疫苗的有效性。殼聚糖衍生物可以保護抗原不被降解，增加抗原在黏膜表面的停留時間，通過配體受體相互作用將抗原靶向M細胞，在免疫系統(tǒng)中大量傳遞抗原，有效誘導全身和黏膜免疫應答反應。
在《殼聚糖衍生物納米疫苗技術與應用》一書中，主要分為兩大部分進行論述，第一部分包括第一章至第四章，該部分綜述了關于豬流行性腹瀉、疫苗佐劑、黏膜免疫以及殼聚糖及其衍生物等相關研究熱點，介紹了如何解決黏膜疫苗發(fā)展面臨的一些關鍵科學技術問題，為殼聚糖衍生物黏膜佐劑發(fā)展提供基礎知識和構建思路，這也是本書編寫的必要性和重要性所在。第二部分包括第五章至第九章，該部分分別以N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖納米粒、N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖/N,O-羧甲基殼聚糖納米粒以及N-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖-鋁（Al）納米粒作為疫苗佐劑和遞送載體，以豬流行性腹瀉滅活病毒為模型抗原，研制新型豬流行性腹瀉納米滅活疫苗，并系統(tǒng)地研究了該疫苗的相關性能和免疫效力。本書是一本系統(tǒng)論述殼聚糖衍生物作為疫苗佐劑和遞送系統(tǒng)的學術專著，可為疫苗佐劑的研制以及進口替代和原始創(chuàng)新提供技術理論支撐并奠定應用基礎。
本書由趙凱教授和金政教授撰稿，其中部分內容參考了碩士研究生曲婉瑩、趙東瑩、于爽和郭思含的畢業(yè)論文，也感謝碩士研究生趙志、董大鵬、鞏曉晨和彭雪，他（她）們?yōu)楸緯馁Y料整理做了大量的工作。全書由趙凱教授審核修改。
感謝浙江省“尖兵”和“領雁”研發(fā)計劃（2022C02031）、浙江省重點研發(fā)計劃（2021C02049）、國家重點研發(fā)計劃子課題（2017YFD0500603）、黑龍江省杰出青年科學基金（JC2018008）、黑龍江省屬高?？萍汲晒嘤椖浚═STAU-C2018017）、2022年度臺州市科技計劃項目（22nya04）和臺州市創(chuàng)新平臺產(chǎn)學研合作專項等科研項目的資助。

趙凱
2023年7月
于臺州學院生命科學學院

第一章 豬流行性腹瀉001
第一節(jié)　豬流行性腹瀉病毒001
一、豬流行性腹瀉病毒形態(tài)001
二、豬流行性腹瀉病毒的分子生物學特點001
三、豬流行性腹瀉病毒致病機制及危害004
四、豬流行性腹瀉病毒的轉運感染途徑005
五、豬流行性腹瀉的流行情況006
六、豬流行性腹瀉病毒基因進化樹分析007
第二節(jié)　豬流行性腹瀉的診斷與控制008
一、免疫診斷技術008
二、分子生物學技術012
第三節(jié)　豬流行性腹瀉病毒疫苗研究現(xiàn)狀014
一、豬流行性腹瀉病毒疫苗發(fā)展歷程014
二、豬流行性腹瀉病毒弱毒疫苗016
三、豬流行性腹瀉病毒滅活疫苗018
四、豬流行性腹瀉病毒基因工程疫苗019

第二章 疫苗佐劑023
第一節(jié)　免疫佐劑的作用及機理023
第二節(jié)　免疫佐劑的分類024
一、化學類免疫佐劑025
二、微生物類免疫佐劑026
三、天然生物類免疫佐劑028
四、生物類免疫佐劑036
五、含脂類物質036

第三章 黏膜免疫038
第一節(jié)　概述038
第二節(jié)　黏膜免疫系統(tǒng)040
第三節(jié)　黏膜免疫接種041
一、黏膜免疫疫苗041
二、黏膜免疫接種途徑041
第四節(jié)　黏膜免疫疫苗佐劑和輸送系統(tǒng)042
第五節(jié)　黏膜免疫中的聚合物納米粒子045
一、殼聚糖及其衍生物在黏膜疫苗中的應用045
二、PLGA 在黏膜疫苗中的應用047
三、透明質酸在黏膜疫苗中的應用047
四、脂類在黏膜疫苗中的應用048
五、PCL 納米粒在黏膜疫苗中的應用048
六、納米聚酸酐在黏膜疫苗中的應用049
七、聚磷腈納米顆粒在黏膜疫苗中的應用049
八、普魯蘭納米顆粒在黏膜疫苗中的應用050
九、海藻酸納米顆粒在黏膜疫苗中的應用051

第四章 殼聚糖及其衍生物052
第一節(jié)　殼聚糖052
一、概述052
二、殼聚糖屬性053
第二節(jié)　改性殼聚糖衍生物054
一、提高殼聚糖的溶解性054
二、提高殼聚糖對pH 的敏感性058
三、提高殼聚糖靶向性能059
第三節(jié)　殼聚糖基納米顆粒060
一、乳液交聯(lián)060
二、離子交聯(lián)061
三、溶劑蒸發(fā)061
四、噴霧干燥061
五、沉淀或絮凝061
六、殼聚糖溶液涂層062
第四節(jié)　殼聚糖衍生物在藥物遞送中的應用062
一、殼聚糖載體狀態(tài)062
二、運載藥物062
第五節(jié)　殼聚糖衍生物在黏膜免疫中的應用065

第五章 N-2-HACC納米粒佐劑068
第一節(jié)　N-2-HACC 納米粒佐劑制備裝置068
一、快速膜乳化裝置結構068
二、N-2-HACC 納米粒制備裝置操作方法068
第二節(jié)　N-2-HACC 納米粒的優(yōu)化070
一、N-2-HACC 納米粒制備方法070
二、N-2-HACC 納米粒制備工藝的優(yōu)化方法070
三、N-2-HACC 納米粒制備條件的優(yōu)化結果071
第三節(jié)　優(yōu)化的N-2-HACC 納米粒佐劑制備工藝及其理化性能079
一、N-2-HACC 納米粒佐劑最佳制備工藝079
二、N-2-HACC 納米粒形態(tài)、粒徑分布、Zeta電位測定080
第四節(jié)　N-2-HACC/PEDV 的制備及其免疫效果評價081
一、PEDV-SZ 株（PEDV-SZ） 的增殖與滅活081
二、N-2-HACC/PEDV 疫苗的制備及免疫效果評價方法082
三、N-2-HACC/PEDV 的免疫效果評價083
四、N-2-HACC/PEDV 納米疫苗設計對免疫效果影響分析084

第六章 N-2-HACC/CMCS 納米粒佐劑086
第一節(jié)　N-2-HACC/CMCS 納米粒佐劑制備條件的優(yōu)化086
一、常用溶液的配制086
二、N-2-HACC/CMCS 納米粒的制備方法086
三、N-2-HACC/CMCS 納米粒的制備工藝優(yōu)化方法087
四、N-2-HACC/CMCS 納米粒添加劑量的確定088
第二節(jié)　N-2-HACC/CMCS 納米粒工藝優(yōu)化及免疫應用088
一、N-2-HACC/CMCS 納米粒制備條件的優(yōu)化088
二、N-2-HACC/CMCS/PEDV 制備及免疫效果評價098

第七章 N-2-HACC/PEDV/CMCS NP101
第一節(jié)　N-2-HACC/PEDV/CMCS NP 制備工藝優(yōu)化101
一、N-2-HACC/PEDV/CMCS NP 的制備101
二、N-2-HACC/PEDV/CMCS NP 制備工藝的優(yōu)化方法101
三、N-2-HACC/PEDV/CMCS NP 制備工藝的優(yōu)化結果102
第二節(jié)　N-2-HACC/PEDV/CMCS NP 理化特性分析112
一、N-2-HACC/PEDV/CMCS NP 理化特性分析方法112
二、N-2-HACC/PEDV/CMCS NP 理化特性分析結果113
第三節(jié)　N-2-HACC/PEDV/CMCS NP 穩(wěn)定性和釋放性研究114
一、N-2-HACC/PEDV/CMCS NP 穩(wěn)定性和釋放性研究方法114
二、N-2-HACC/PEDV/CMCS NP 穩(wěn)定性和釋放性研究結果116
三、納米疫苗結果分析119

第八章 多糖對豬流行性腹瀉N-2-HACC/CMCS納米粒滅活疫苗免疫效果的影響120
第一節(jié)　不同佐劑豬流行性腹瀉納米滅活疫苗的篩選120
一、相關溶液的配制方法120
二、豬流行性腹瀉病毒的增殖與滅活121
三、不同佐劑豬流行性腹瀉納米滅活疫苗的制備方法121
四、最佳佐劑組合豬流行性腹瀉納米滅活疫苗的篩選方法123
五、最佳佐劑組合豬流行性腹瀉納米滅活疫苗的篩選結果124
第二節(jié)　N-2-HACC/鋁膠/APS/PEDV/CMCS的理化特性126
一、N-2-HACC/鋁膠/APS/PEDV/CMCS 的pH檢測126
二、N-2-HACC/鋁膠/APS/PEDV/CMCS 表面形態(tài)126
三、N-2-HACC/鋁膠/APS/PEDV/CMCS 粒徑分布126
四、N-2-HACC/鋁膠/APS/PEDV/CMCS 包封率、載藥量的測定126
第三節(jié)　N-2-HACC/鋁膠/APS/PEDV/CMCS 的安全性檢測128
一、N-2-HACC/鋁膠/APS/PEDV/CMCS 的無菌檢驗128
二、N-2-HACC/鋁膠/APS/PEDV/CMCS 的體內安全性檢驗129
第四節(jié)　N-2-HACC/鋁膠/APS/PEDV/CMCS穩(wěn)定性考察132
一、耐酸性測定132
二、腸溶性測定133
三、耐膽鹽測定133
四、體外釋放性的考察134
第五節(jié)　N-2-HACC/鋁膠/APS/PEDV/CMCS免疫效果的評價135
一、免疫效果的評價方法135
二、免疫效果的評價結果137
三、免疫效果分析149

第九章 N-2-HACC-Al 納米佐劑在豬流行性腹瀉滅活疫苗中作用效果的評價152
第一節(jié)　N-2-HACC-Al NP 合成工藝條件的優(yōu)化152
一、溶液及其配制方法152
二、N-2-HACC-Al NP 的合成154
三、單因素優(yōu)化N-2-HACC-Al NP 合成工藝條件154
四、N-2-HACC-Al NP 合成工藝條件優(yōu)化的響應面設計160
第二節(jié)　N-2-HACC-Al NP 理化性能測定166
一、N-2-HACC-Al NP 形態(tài)和粒徑的測定166
二、鋁結合效率和N-2-HACC 結合效率的測定167
三、N-2-HACC-Al NP 顆粒表面元素分布169
第三節(jié)　N-2-HACC-Al NP 穩(wěn)定性和安全性評價170
一、N-2-HACC-Al NP 的穩(wěn)定性分析170
二、N-2-HACC-Al NP 的體外降解性考察172
三、N-2-HACC-Al NP 的細胞毒性檢測172
第四節(jié)　N-2-HACC-Al NP/PEDV 的制備和免疫效果評價174
一、N-2-HACC-Al NP/PEDV 的制備174
二、N-2-HACC-Al NP/PEDV 免疫效果的評價方法175
三、N-2-HACC-Al NP/PEDV 免疫效果的評價結果176
四、免疫增強效果分析187

參考文獻190